益气温阳法治疗慢性免疫性血小板减少症疗效及T/B淋巴细胞

　　摘要：本研究基于麻柔导师多年治疗CITP经验方，目的在于探讨益气温阳法临床疗效及免疫疗效机制。本研究治疗组总病例数28例，显效4例(14.29%);良效3例(10.74%);总有效率42.86%。治疗组治疗前平均Plt计数23.02±13.69;治疗后平均计数46.18±50.47，治疗前后血小板均数经t检验，P<0.05，治疗前后血小板变化具有显著性差异。淋巴细胞亚群研究提示，CITP患者机体免疫紊乱中Treg细胞和CD19+CD5+B细胞比例下调及功能缺陷、以及CTL细胞、NKT细胞、CD3DR+活化T细胞的功能亢进是其致病机制中重要环节。治疗前后研究提示，益气温阳汤通过显著降低总T细胞、NKT细胞、CD3DR+活化T细胞比值;升高CD19+CD5+/CD19+比值、CD4+CD25+Treg细胞和Th2细胞，起到免疫调节和免疫耐受作用，有助于改善外周血小板水平。值得注意的是，治疗无效组CTL细胞和CD3+DR+活化T细胞高表达，并不因治疗干预而下降，说明益气温阳汤不通过CTL细胞和CD3+DR+活化T细胞途径起作用，亦或提示CTL和CD3+DR+活化T细胞功能增强可能与ITP治疗效果差相关。

　　关键词：免疫性血小板减少症;益气温阳法;T、B淋巴细胞亚群;

　　免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia，ITP)”病程持续12个月以上者称为慢性ITP (cITP)。cITP具有易反复发作、治疗难度大、治疗效果差等特征。由疾病本身和治疗相关因素导致的死亡率比正常人群高出 4.2倍。cITP常经过多种方案治疗后血小板仍持续在安全范围以下，治疗非常棘手，现代医学采用大剂量糖皮质激素、免疫抑制剂、化疗药物、生物制剂(α-干扰素、静脉丙种球蛋白、rhTPO)、单克隆抗体(利妥昔、阿伦单抗)、血浆置换、免疫吸附等单独或联合措施治疗，但文献报导疗效差异很大。这些药物中多数治疗周期较长，停药后复发率高，不良反应明显。本研究基于麻柔主任医师多年治疗CITP经验方，探讨益气温阳法临床疗效及免疫机制。

　　一、研究方法

　　1. 诊断标准

　　西医诊断标准参照2007年张之南主编《血液病诊断及疗效标准》中制定的特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)的诊断标准：中医证候诊断标准：参照1987年8月全国中医急症研讨会修订方案，结合2002年《中药新药临床研究指导原则》拟定。脾肾两虚证辨证参照脾肾阳虚型和气血亏虚型证候标准:①主症:基本无出血证候，或紫癜色淡红或暗而稀疏，伴神倦乏力，尤以双下肢乏力明显，或畏寒肢冷，腰膝酸软，喜热饮，大便溏泄，多尿;②次症：头晕，心悸，气短，五更泄泻。舌象：舌淡或淡胖，或舌边齿痕，苔薄白;脉象：脉沉迟或脉弱。具主症2项以上;或1项主症加1项以上次症，再加舌脉象即可诊断。

　　2. 病例入选标准

　　1)符合慢性ITP诊断标准，病程>12个月;2)相隔一周左右连续2次的平均血小板计数<50×109/L，且不服用激素或泼尼松服用量≤10mg;3)符合中医脾肾两虚型辨证分型;4)年龄在14～75岁之间;5)未参加其他临床研究，自愿受试。

　　3. 药物及观察方法

　　治疗组药物由太子参30、炒白术10、茯苓10、炙甘草10、桂枝10、白芍10、锁阳20、仙灵脾10、川萆薢10、巴戟天10、补骨脂15、生姜10、大枣10枚组成，具有健脾益气、温肾助阳功效。剂型为汤剂。一日一剂，早晚分2次服用，每个月根据患者症状适当加减。共观察4个月。

　　4. 观测指标

　　4.1 外周血象：血小板计数、白细胞计数、血红蛋白含量。

　　4.2 外周血T、B淋巴细胞亚群检查

　　采用美国BECKMAN COULTER公司流式细胞仪三色荧光直接免疫法检测T、B淋巴细胞亚群，主要包括CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+比例、CD3-CD16CD56+NK细胞、NKT细胞、CD3+CD25+ 、CD3+DR+活化T细胞、CD4+CD25+Treg细胞、CD19+B细胞及CD19+CD5+/CD19+比值，探讨CITP病人免疫紊乱状态及疗效机理。

　　5. 疗效判断标准及统计方法

　　西医疗效评判标准：参照张之南主编《血液病诊断及疗效标准》ITP疗效标准。应用SPSS statistics17.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差( )表示，计量资料应用t检验，组间差异的显著性先用Levene’s test行方差齐性检验，再行独立样本或配对样本t检验，根据方差齐与否，选择检验结果。

　　二、研究结果

　　1. 临床疗效研究

　　治疗组服用益气温阳方，疗程4个月，后期随访6个月。观察期内病情稳定，血小板波动在1万以内的视为无效病例。治疗组总病例数28例，显效4例(14.29%);良效3例(10.74%);进步5例(17.86%);无效16例(57.14%);总有效12例;总有效率42.86%。治疗组中观察期内使用强的松者共5例，均为入组时已长期合并应用，每日剂量均低于10mg。3例观察期内由10mg减至5mg，其中1例显效，1例进步，1例血小板计数维持不变;1例全程用10mg/日，血小板维持不变;1例全程5mg/日，血小板计数未有变动。

　　表1、治疗前后血小板均数比较( )

　　(注：*P<0.05, 说明治疗组治疗前后血小板变化具有显著性差异)

　　表1结果显示：治疗组治疗前平均Plt计数23.02±13.69;治疗后平均计数46.18±50.47，治疗前后血小板均数经t检验，t值-2.585，P=0.015，治疗前后血小板变化具有显著性差异(P<0.05)。后期观察6个月，显效病例中1例4个月后plt降至80×109/L，目前波动在80×109/L~90×109/L，余病例病情稳定。全部病例观察期间未出现不适不良反应。

　　2. T、B淋巴细胞免疫紊乱研究

　　本研究可供分析病例25例，检测指标包括：CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比例、CD3-CD16CD56+NK细胞、CD3+CD16CD56+NKT细胞、CD3+CD25+ 活化T细胞、CD3+DR+活化T细胞、CD4+CD25+Treg细胞及Th1/Th2/Th0、CD19+总B淋巴细胞、CD19+CD5+B淋巴细胞表达变化。

　　表2-1：治疗前后T、B淋巴细胞亚群表达( )

　　(注：治疗组治疗前后比较* P<0.05，**P<0.01;与健康对照相比#P<0.05,## P<0.01)

　　表2-2：治疗前后T、B淋巴细胞亚群表达( )

　　(注：治疗组治疗前后比较* P<0.05,**P<0.01;与健康对照相比#P<0.05;## P<0.01)

　　表2-3：治疗前后Th1、Th2、Th0表达比较( )

　　(注：治疗组治疗前后Th1, Th2, Th0均数检验 P>0.05)

　　表2比较了治疗组治疗前后T、B淋巴细胞亚群变化，并与健康人群为对照。结果：治疗组与健康对照组相比，治疗前CD3+总T细胞、CTL细胞、CD3+DR+活化T细胞、NKT细胞显著增高，但调节T细胞(Treg)、CD5+B淋巴细胞比值显著降低(P<0.05)，经治疗后CD3+总T细胞、NKT细胞比值显著性下降(P<0.05);CD19+CD5+/CD19+比值、CD4+CD25+Treg细胞显著性升高(P<0.01);CTL淋巴细胞、CD4+/CD8+比值与治疗前相比无明显改善(P>0.05);CD3DR+活化T细胞治疗后虽明显改善，但与健康组相比仍具显著性差异(P<0.05)。治疗前后治疗组Th1、Th2、Th0各项指标变化无统计学意义(P>0.05)。

　　为进一步验证这些指标在CITP发病和缓解中的作用，将治疗组分为有效组和无效组进一步探讨。结果见表5。

　　表3-1：有效组前后T、B淋巴细胞亚群比较( )

　　(注：有效组治疗前后比较 * P<0.05,** P<0.01;治疗前后与健康对照相比# P<0.05)

　　表3-2：无效组前后T、B淋巴细胞亚群比较( )

　　(注：无效组治疗前后比较 * P<0.05,** P<0.01;治疗前后与健康对照相比# P<0.05,##P<0.01)

　　表3-1治疗有效组研究显示：CD4+CD25+Treg细胞和CD19+CD5+B细胞显著性上升，治疗前后差异具有统计学意义(P<0.01;P<0.05)。Th2细胞治疗后显著上升，治疗前后具有显著性差异(P<0.05)。表3-2治疗无效组研究显示：CTL细胞和CD3+DR+活化T细胞治疗后未见明显下降，与健康对照组相比仍具显著性差异(P<0.05)。

　　三、讨论

　　目前ITP的治疗以糖皮质激素、免疫球蛋白、切脾以及其他免疫治疗为主。糖皮质激素+免疫球蛋白的有效率达到70%~80%，强的松起效后减量过程中容易复发，强的松停药后仅10%~20%的病人长期缓解无需治疗。随着对ITP致病机理的进一步的认识，一些靶向T、B淋巴细胞的治疗策略已被应用,并取得了一定的效果。相对高选择性的靶向治疗如抗CD20单克隆抗体、抗CD52单克隆抗体、抗CD40L(CD154)单克隆抗体及B7阻滞剂等越来越受到重视。这些治疗是基于ITP发病的免疫机制，通过从分子水平阻断或干预抗血小板抗体产生，从而达到减少血小板破坏的目的。CR+PR 25%~50%。这些药物价钱昂贵，很难作为一线用药。

　　目前现代医学认为：对ITP患者治疗前，应评价患者的风险/收益比，对于血小板计数高于30×109/L无明显出血的ITP患者一般无需治疗，仅在手术、拔牙或分娩等可引起出血的情况下，才需要治疗。

　　得出这种结论的原因在于，目前治疗药物副作用大，安全性较低，长期治疗患者的风险/收益比太高。血小板计数高于30×109/L的患者虽没有急性严重出血的风险，但破坏血小板的病理状态未完全改善，多数因感染等原因导致病情反复，降低生存质量。所以作者认为，有必要探寻安全有效的治疗方案，这方面中医中药治疗可发挥其优势和特长。

　　导师麻柔教授根据其多年临证经验，治疗ITP提出一套辨病辨证结合思路，指导临床，疗效显著。麻老认为，慢性ITP病人主诉症状少，临证关键在于抓住主要病机、病位，辨证准确，这是临床取得良效的基础。麻老提纲挈领地总结出ITP病机：在急性期以“火盛”为特点;慢性期以“气伤”为特点。本病急性期除以“火盛”为病机特点外，外感诱发者多见。具体病机为：外感邪热或内热伏扰营血，灼伤脉络，迫血妄行所致。在火热之中，又有实火与虚火之分。外感风热燥火，内蕴之火，肝郁化火等，均属实火;而阴虚火旺之火则属虚火。此期紫癜颜色鲜红密布，出血症状较重。

　　慢性期所谓气伤即气虚，气虚则气血生化不足和统摄无权，则血溢脉外。即《景岳全书·血证》记载：“损者多由于气，气伤则血无以存。” 肺主一身之气，又脾肾为先后天之本，后天气血及元阴元阳由此化生，故麻老认为：CITP“气伤”具体表现为肺脾气虚和脾肾两虚。初期表现以气虚为主，病情迁延日久，损及阳气，临证见四肢不温，喜热饮，舌淡胖边有齿痕，脉沉等阳气虚损之象。此期紫癜颜色淡红稀疏或没有明显出血点。CITP急性发作期及反复的病人多表现为虚实挾杂，以虚为本，以火、瘀为标的特点，多因外感或过劳诱发。瘀血既是病理产物也是致病因素，始终贯穿于整个疾病过程。

　　实际临证中单纯肺脾气虚型少见，多以脾肾阳虚兼见肺脾气虚之象，麻老抓住脾肾阳虚，肺脾气虚之疾病根本，以益气温阳为大法，拟参桂益气温阳汤作为治疗CITP基本方，加减运用临证取得良好疗效。方中有：太子参、炒白术、茯苓、炙甘草、桂枝、白芍、锁阳、仙灵脾、川萆薢、生姜、大枣。

　　方中参苓白术草，取四君子之意健脾益气，顾气虚之本;锁阳、仙灵脾益肾助阳，益火补土;《医方考•血证门》记载：“血营卫气，胥有义焉。阴在内，阳之守也，故曰营。阳在外，阴之卫也，故曰卫。二者易调而不易病，血一不调，则营守乎中者，反出于外而败之”。方中桂枝汤调和营卫，顾护肺卫，既有助于紫癜的吸收，也有利于抵御外感邪热侵扰，一举两得之功。

　　临证加减：伴有咽部不适，咽痒，加土茯苓、公英以清利咽喉，清热解毒;月经量过多，加益母草、干地黄、旱莲草、当归滋阴养血，凉血止血;长期激素依赖者加女贞子、仙灵脾;肾阳虚明显酌加补骨脂、菟丝子、巴戟天等，临证应用屡获良效。

　　本研究治疗组总病例数28例，显效4例(14.29%);良效3例(10.74%);总有效率42.86%。治疗组治疗前平均Plt计数23.02±13.69;治疗后平均计数46.18±50.47，治疗前后血小板均数经t检验，P<0.05，治疗前后血小板变化具有显著性差异。

　　本次研究探寻中医益气温阳法治疗CITP理论依据及临床疗效，理法方药上有别于以往益气养阴及清热凉血法。研究证明，益气温阳方治疗CITP临床疗效确切，显著提升患者PBC，远期疗效稳定可靠，明显提高患者生活质量。不失为疗效明确，安全可靠的CITP治疗方案，具有一定社会推广价值和经济效益。

　　此次淋巴细胞亚群研究提示，CITP患者机体免疫紊乱中Treg细胞和CD19+CD5+B细胞比例下调及功能缺陷、以及CTL细胞、NKT细胞、CD3DR+活化T细胞的功能亢进是其致病机制中重要环节。治疗前后研究提示，参桂益气温阳汤通过显著降低总T细胞、NKT细胞、CD3DR+活化T细胞比值;升高CD19+CD5+/CD19+比值、CD4+CD25+Treg细胞和Th2细胞，起到免疫调节和免疫耐受作用，有助于改善外周血小板水平。值得注意的是，治疗无效组CTL细胞和CD3+DR+活化T细胞高表达，并不因治疗干预而下降，说明益气温阳汤不通过CTL细胞和CD3+DR+活化T细胞途径功能起作用，或提示CTL和CD3+DR+活化T细胞功能增强可能与ITP治疗效果差相关。