血小板检测方法可归纳为出血、血栓和药物监测3大类。虽则有些方法能应用于多种检测目的，但为特殊目的而创建的方法亦有重要价值。故在检测时应合理地运用。
　1 出血性疾病监测中的应用
血小板的基本功能是黏附、聚集、分泌、促凝血、血块回缩。通过这些功能维持着正常人体的初期止血作用。由于这些功能异常而导致的出血疾病包括遗传性和获得性两类，在有些疾病同时会有血小板功能异常和数量减少。
1.1 遗传性血小板功能异常疾病
① 黏附受体蛋白异常：GPIbⅤⅨ(BSS,血小板型vWD,BolinJamieson 综合征)、GPⅡb/Ⅲa(血小板无力症)、GPⅠa/Ⅱa、GPⅥ、GPⅣ。
② 可溶性激动剂受体异常:TXA2受体,P2Y12受体、α2肾上腺素能受体。
③ 血小板颗粒异常:δ颗粒(δ贮存池缺陷、HermanskyPudlak综合征等)、α颗粒 (灰色血小板综合征，Quebec血小板病等)。
④ 信号传递途径异常:TXA2途径异常、Ca离子流动异常、Gαq缺陷、GSα高反应、PLCpleckstrin磷酰化缺陷。
⑤ 膜磷脂异常:Scott综合征、Stormorken综合征。
⑥ 其他异常:原发性释放异常、Montreal综合征、EhlersDanlos综合征、 MayHegglin综合征等
1.2 遗传性血小板数量减少疾病
① 体积减小：WiskottAldrich综合征、性联血小板减少症。
② 体积正常：家族性血小板病、先天性无巨核细胞性血小板减少症。
③ 体积增大：巨大血小板综合征、血小板型vWD、MayHaegglin异常、灰色血小板综合征、Montreal血小板综合征。
1.3 获得性血小板功能异常 这种异常十分常见，可由下列不同原因引起：① 药物、食物和维生素;② 慢性肾衰;③ 体外循环;④ 骨髓增生异常疾病;⑤ 抗血小板抗体等。
血小板功能缺陷检测的方法包括：① 血细胞分析仪在测定血小板数量及外形大小中应用;② 血小板功能:出血时间(血小板功能分析仪，(FPA100R)、 黏附性测定、 聚集功能测定、 释放功能测定(致密颗粒：5HT、ADP、ATP、δ颗粒缺陷HermanskyPudlak 综合征、ChediakHygashi 综合征(荧光法)、α颗粒：TF4、βTG(α颗粒缺陷灰色血小板综合征、Quebec 血小板病、Jacobsen或ParisTrousseau 综合征)(ELISA法，试剂盒),PF3有效性; Ca2+释放与内流,、血栓烷形成、cAMP、GAMP;血块回缩;③ 膜受体分析采用流式细胞术和电泳术(黏附受体GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb，激动剂受体P2Y12、GPⅥ);④ 基因分析采用分子生物技术;⑤ 其他(超微结构)。
上述检测方法目前巳成为疾病诊断的基本手段，但随着对疾病的病理机制的深入研究以及包括血小板信息传递在疾病中的新的认识，许多蛋白分析技术巳逐渐成为研究方法中的一部分，但它们的应用可能仅限于研究目的而言，而不适合一般医院的临床检测应用。
血小板体积测定不仅能反映血小板生成及衰老，而且在鉴别遗传性血小板疾病中也是一项十分有用的指标。在巨大血小板综合征中的巨大血小板在末梢血涂片可达80%，其直径达到20 μm以上。最新也有报道非巨大血小板综合征而血小板体积明显增大数量减少病因不清的遗传性巨大血小板减少症。体内出血时间结合血小板数曾是血小板数量与质量异常所致出血的筛选试验，但由于出血时间存在种种不足而被弃之不用。血小板黏附性所测得的结果是血小板聚集和黏附的总和，不能独立反映黏附功能也被弁之。
PFA100TM是一种模拟体内初期止血的测定仪，又名“外出血时间”，结果以血小板闭塞网眼停止血液流动的“闭合时间”表示。故可以检测与血小板黏附、聚集、栓子形成的初期止血障碍相关的疾病，血栓性疾病、GPⅡb/Ⅲa拮抗剂等抗血小板药物监测、血小板贮存、血管性血友病及DDAVP治疗、肝肾功能疾病等。与出血时间试验相比，在诊断vWD中的敏感性>90%。由于此项检测所需费用较高，限制了其广泛应用。
血小板聚集性测定是被应用最广泛、发展和改进最多的一项测定。至今为止，巳发展而成的血小板聚集仪包括有比浊法、阻抗法(全血血小板聚集仪)、光散射法和Verify Now分析仪(Ultegra快速血小板功能分析仪)。在测定血小板聚集的仪器中，设计有可以同步测定血小板腺核苷酸释放和血小板胞浆Ca2+浓度的装置，具有多功能性。
比浊法最常用，诱导剂通常为ADP、胶原、花生四烯酸和瑞斯托酶素等4种。但存在标本分离、制备、诱导剂种类与浓度选择、正常值设定等影响因素，缺乏各实验室之间的可比性。在一项误差分析中，其总体的SD为3.7%～7.7%。所以，对一份聚集率为64.81%±7.7%,其分布范围49%～80%，从个体化角度进行判断分析时，其意义较为有限。在遗传性血小板功能性疾病中,由于聚集反应显著下降，这类误差不影响临床诊断，是一项十分有用的指标。
其他各项试验譬如颗粒释放产物、花生四稀酸代谢产物，血小板膜磷酯酰丝氨酸、Ca2+、膜糖蛋白、基因分析等项目在诊断疾病中仍被继续广泛应用，是诊断血小板功能疾病所必需的基本检测项目。但由于遗传性血小板疾病在临床上颇为少见，一般医院很难具有独立地全面检测这类疾病的能力，许多试验仍未能广泛应用展开。
2 血栓性疾病监测中的应用
在血栓性疾病中存在着血小板的短暂或持续活化。活化的血小板其形态、功能或蛋白的结构变化，这些变化构成了活化标志物检测的基础。目前用于血栓性疾病检测的方法有:
2.1 血小板聚集 是至今为止在检测血栓性疾病中仍能应用的一项试验，但其灵敏度不高。譬如比浊法，它既不能检出低于5个血小板组成的聚集反应，也不能检测循环血小板聚集体。鉴于这些需求，随后出现了一些新的方法，譬如Wu & Hoak报道的全血血小板聚集体检测法,血小板对ADP/AA聚集反应阈值和自发性血小板聚集体测定法, 检测血小板聚集反应中所形成大小不同的聚集体激光衍射法，或采用血小板计数仪测定聚集后的标本中剩余的血小板数等。PA200型聚集仪(Kowa,Japan)是通过光散射及一系列复杂镜片组建成的激光衍射仪，能检出PRP中由2至3个血小板组成的聚集体。用此项检查，发现在急性冠状动脉综合症中存在<100个血小板组成的聚集体，现已应用于急性冠状动脉综合征、脑卒中和TTP等血小板高反应性疾病中。但在遗传性的黏性血小板综合征中，患者血小板对ADP和/或肾上腺素诱导的血小板聚集反应增高，采用比浊法血小板聚集仪即可予以诊断。
血小板聚集虽然存在不灵敏的反映血栓形成，但最近人们发现，通过计算方法的改进成为可预示经皮冠脉介入治疗后患者心肌损伤的标志物。2007年Marcucci等在367例PCI后发生急性心梗患者的心肌损伤测定中进行了此项研究。此项方法命名为残留血小板反应性(residual platelet reactivity,RPR)检测法。它以血小板聚集率和PFA100中测得的闭合时间为基础，以超出对照组血小板聚集率第90%者值或低于PFA100中闭合时间203 s(CT/EPI )作为临界值，计算 RPR。采用此法检测时所测得的RPR值与反映心肌梗死的指标CKMB和cTnl基本一致(P<0.0001)，是当前以血小板功能检测来反映心肌梗死的较好的方法。
2.2 网织血小板测定 此系2008年Cesari 等描述的一项能反映ACS的有用指标。其原理是血小板中残存的mRNA用噻唑橙黄荧光染料标记，在Sysmex XE2100 血液分析仪中测定。观察网织血小板百分率%(IPF)和反映mRNA总量的荧光强度%(HIPF )。在ACS组中IPF和HIPF明显升高，表明ACS中血小板周转加快。
2.3 活化标志物 分可溶性与非可溶性两类。
2.3.1 可溶性血小板活化标记物 βTG、 PF4、TXB2、 5HT，P选择素、Ca2+。
血小板颗粒内容物的释放产物PF4和βTG曾作为血小板储藏池疾病和血小板活化标志物，但由于在操作过程中常可引起血小板体外活化，故二项 指标已逐渐为其他指标所替代。
过去几年采用过的前列腺素代谢产物TXB2,在作为反映血小板活化方面也因存在体外活化的问题，而11去氢 TXB2是相对稳定的终末产物，其结果更可靠。P选择素存在于血小板和内皮细胞。血小板表面的P 选择素是活化过程中α颗粒膜上的P 选择素与血小板表面膜整合产物，在静息血小板表面上很少，是血小板活化的较特异的标志物。但活化血小板表面的P 选择素与血液中白细胞相互作用后很快丢失，因此，这项指标在反映活化程度中的灵敏度也有所降低。可溶性P 选择素虽则在几年前也被视为血小板活化标志物，但1997年Fijnheer通过在ITP、TTP等的观察中，证明可溶性 P选择在正常人中的主要来源是血小板，但在许多疾病状态时是来源于内皮细胞，其特异性不如血小板P 选择素。在作为血小板活化标志物的选择上应选用血小板表面P 选择素。
作为细胞信使的某些成份如cAMP、Ca2+等在血小板基础研究中予以应用，其中血小板胞浆Ca2+浓度的测定随着它与某些临床疾病之间关联的发现，现已在血脂增高和降血脂治疗，以及动脉粥样硬化患者中检测应用。常用方法是采用Fura2的荧光法，也可采用带有钙离子浓度测定的血小板聚集仪。
2.3.2 非可溶性血小板活化标记物 CD 62p、CD 63、LAMP1、CD40L、GPⅡb/Ⅲa、磷脂酰丝氨酸,微粒,白细胞单核细胞聚集体,微小血小板聚集体。
血小板膜糖蛋白Ⅰb、Ⅱb/Ⅲa、Ⅴ、Ⅰa等是参与血小板黏附和聚集功能的主要黏附蛋白，在一些遗传性血小板疾病中明显下降，而在血栓性疾病中也可见到某些糖蛋白表达增高。采用相应的单抗可检测这些膜糖蛋白在膜表面表达量及血小板活化时的分子构型改变，作为血小板活化标志物。
CD 40L位于α颗粒，血小板活化时表达在血小板表面，参与血小板间，或与白细胞间黏附和聚集，与P选择素相似，是活化的重要标志物。表达在血小板表面的CD 40L断裂后流入在血液中，则为可溶性CD 40L(sCD 40L)。在血小板表面及血液中的CD 40L是目前临床应用的两个活化标志物。
新近报道的血小板活化标志物包括血小板促凝活性、微粒和单核细胞血小板聚集体检测等3项指标，在一些文献中已有应用报道，其敏感性可能优于现用的金标准P选择素。血小板促凝活性采用能与磷酯酰丝氨酸结合的Annexin V作标志物，通过流式细胞仪测定与Annexin V 联结的FITC荧光强度，可获得血小板表面参与凝血反应的磷酯酰丝氨酸的量。
血小板微粒是血小板活化时从血小板囊孢脱落或伪足断裂而存在血液中的颗粒,直径为0.1～1 μg。血小板颗粒表面含有血小板特有的蛋白，譬如GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb、P选择素和PAF等。在流式细胞仪中根据上述显示血小板特征的标志物再结合颗粒大小可以与血小板及来源淋巴细胞、内皮细胞区别开，予以定量。微粒生成的机制可能与血小板黏附聚集、免疫复合物及依赖与不依赖补体的抗体作用有关。在临床上巳报道了在某些疾病中微粒数量减少，譬如Scott综合征、逆Scott综合征等，而有些疾病中微粒数量增高，譬如ITP、TIA、急性冠脉综合征、糖尿病、抗磷脂抗体综合征等。单核细胞血小板聚集体在急性冠脉综合征、心肌梗死中增高，在这类血栓性疾病中血小板GPV也明显升高。基因分析主要限于膜表面的几种糖蛋白( b、b/a、V、PLA1、PLA2等)。现巳报道血小板GPⅢa,GPⅠb和GPⅠa基因多态性与血栓性疾病相关。
不同方法在血栓性疾病检测中的灵敏度为：P选择素、DHTXB2、促凝活性(PPA)、微颗粒 (PMP)、膜糖蛋白、白细胞血小板聚集体、微小聚集体> TXB2、 TSP、βTG>血小板聚集。
血小板检测在血栓性疾病中具有多方面的应用价值，包括血栓前状态的检测; 指导抗血小板药物治疗及疗效判断; 血栓性疾病的鉴别诊断; 预后。譬如缺血性脑卒中其CD 62,CD 63升高在脑血管自身病变引起的患者较心源性中为高;在急性心肌梗死与心绞痛比较时，前者血小板单核细胞聚集体高于后者。在用阻抗法检测孕妇是否发生先兆子痫时，在妊娠25周前用ADP,胶原或花生四烯酸诱导血小板聚集增高时，其阳性预示率几乎100%。
3 药物监测中的应用
实验室监测抗血小板药物的目的在于药物的安全性和有效性。安全性主要是指出血副作用，但在常规的剂量下，药物的出血副作用是很轻微，通常不需监控。随着ASA和氯吡格雷“抵抗性”的报道，引起了人们的重视。在过去的20多年中，人们对不同方法在“抵抗性”方面检测意义作了评估。由于每一种药物都有它们特定的作用点靶向，检测需要能反映靶向的状态。 “抵抗性”的检测从原理、方法上与出血疾病和血栓性疾病间存在着很大区别。
3.1 ASA抵抗性及其监测： ASA是应用最广泛的血小板聚集的抑制剂，它通过乙酰化环氧化酶1(COX1)中529位丝氨酸的羟基而不可逆地灭活该酶活性，而阻碍花生四烯酸与385位酪氨酸的活性位点结合，阻止血栓烷A2(TXA2)的形成。
ASA抵抗性的定义包括实验室定义和临床定义，前者以实验室检测指标判断，ADP诱导的血小板聚集率高于特定水平，显示抑制作用很低;后者以临床缺血事件发生率来评定。ASA抵抗性早在1993年Grotemeyer等发现在脑卒中患者有报道，2005年Campbtell等汇总文献资料，根据血小板功能(出血时间、血小板聚集比值、比浊法、全血法血小板聚集、11去氢TXB2以及PFA100TM等)检测的结果，显示采用不同检测方法和判断标准所报道的ASA抵抗性发生率范围相当大(8%～64%)，而采用特异的靶向反应及其产物相关的试验血清TXB2和花生四烯酸诱导的血小板聚集试验，ASA抵抗性的发生率并不高，仅为1%～1.7%和<1%。由于ASA抵抗性者的血栓形成发生率增高，因此，尽管存在着定义、检测方法、发生率以及机制等方面的认识差异和争议，但对抵抗性检测是否纳入临床常规检测尚无一致意见。
Michelson等2006年在欧洲心脏病杂志提出监控ASA抵抗性推荐的检测指标，而以血清TXB2为优选项目：
① 血栓烷作为终点:血清TXB2, 尿11去氢TXB2。② 花生四烯酸作为刺激剂: 比浊法血小板聚集仪, 阻抗法血小板聚集仪、Verify Now 阿司匹林分析法、Plateletworks、 血小板表面活化的GPⅡb/Ⅲa、血小板表面P选择素、 白细胞–血小板聚集体 (流式细胞仪)、 TEG 血小板绘图仪、 锥板式血小板分析仪、T导向装置型血栓显示器。③ 其他。PFA100TM，PlaCor PRT 尿11去氢TXB2在病理状态下约1/3来源于非血小板成份，所以特异性不强。血清TXB2的灵敏度高，特异性强，能较好地反映ASA作用靶向的环氧化酶1的抑制状态，但其存在检测方法上快速提供结果的限制。而在我国的医院中,比浊法血小板聚集仪广用比较广泛，虽然其操作技术要求比较高，存在许多不足，但能当天提供结果，及时指导对患者的用药，同时采用花生四烯酸诱导的血小板聚集反应，能反映出COX1的抑制程度，因此适合目前条件下大多数实验室的监控要求。2008年Guthikonda等采用亚最大浓度的花生四烯酸作为聚集诱导剂时，发现ASA抵抗者的聚集反应较无抵抗者高。提示了这类患者有可能在用药前检出。如果此项结果得以进一步证实，在临床上有较大意义。
3.2 氯吡格雷抵抗性及其监测： 人血小板ADP受体属于P2型，有P2Y12、P2Y1两种，噻氯匹定和氯吡格雷为ADP的P2Y12受体拮抗剂。
2003年德国Müller等在105例稳定性冠状动脉疾病作PCI时使用氯吡格雷中约有5%患者对药物呈无反应，这些人术后发生血栓形成增高。随后氯吡格雷“抵抗性”得到进一步证明。在Matetzky等报道中指出，非ST段升高心梗作PCI患者用ADP聚集试验检测时抵抗性发生率为25%。 Gurbel等用P选择素和GPⅡb/Ⅲa检测时，抵抗性发生率在5 d为31%，在30 d为15%。目前认为，氯吡格雷“抵抗性”依据使用的定义和检测方法不同约为5%～43%。据Matetzky等报道,有抵抗性的患者.在半年随访中者发生不良事件占40%。有抵抗性者的临床预后欠佳。
许多检测方法巳作过评估，适用者有：
(1)全血血小板聚集(血小板计数法)：在全血中加入诱导剂，计数全血中单个血小板数的减少视作为血小板聚集体形成。方法简易，较比浊法敏感，它能检测到非常小的聚集体。尚缺乏大量应用的经验。
(2)血栓弹力图：检测全血中血块形成时的黏弹性变化，故其结果受血小板功能、凝血因子、天然抗凝因子和纤溶影响。对ASA和氯吡格雷监测灵敏度可以接受。
(3)锥板分析仪：提供高剪切应力的层流，适于验检测vWD和GPⅡb/Ⅲa拮抗剂，在小规模研究中，能检测对氯吡格雷的弱反应者。
(4)Verify Now分析仪(accumetrics verify now assay,)测定：枸橼酸全血中加入诱导剂TRAP使血小板与纤维蛋白原珠凝集时的透光度增加，凝集程度与透光度增加呈正比，结果以mV/10s报告。Verify Now分析仪优点:获得结果快(1 min),可床旁监测，不需标本运送; 仅需少量血标本;血液不需要处理，操作简便; 检测结果经微处理器后以数字显示; 检测结果不受抗凝剂和致聚剂的影响。是目前上市的新的血小板功能测定仪。最初是用街GPⅡb/Ⅲa拮抗剂监测，目前也被推荐在其他药物监测中应用。
(5)血小板舒血管剂刺激磷酸蛋白(VASP)流式细胞仪测定：其原理为：VASP是 ADP引起的血小板聚集反应时信息传递途径中的重要环节，是氯呲格雷通过P2Y12受体的生化学的靶。VASP为cAMP和cGMP激酶的底物，磷酸化位点分别在Ser 157和Ser 239,该蛋白活化时抑制GPⅡb/Ⅲa、PLC活化和钙动员。氯呲格雷阻断与ADP在血小板膜上的P2Y12受体偶联的Gi释放αGi和βγ,从而使cAMP升高，抑制VASP的磷酰化发生，致使GPⅡb/Ⅲa上纤维蛋白原受体活化受抑。血小板反应指数VASP(Platelet reactivity index VASP,PRI VASP)的临界值是>53%,其阴性预示值为99%，阳性预示值为12%,其灵敏度为93%,特异性为50%。预示在无ST段升高的急性冠脉综合征(ACS) PCI后头一个月的CV发生可能性。因此，此项指标除作为监测氯吡格雷抗血小板作用外，也是无ST段升高的急性冠脉综合征临床结局(作PCI者)的良好预示标志物, PRI VASP值升高预示氯吡格雷低反应者伴有复发性心肌缺血事件发生的增加。
(6)MeSAMP试验：此法由Neubauer于2008年描述。MeSAMP为血小板P2Y1抑制剂，当MeSAMP存在时，血小板对ADP的反应由于P2Y1被MeSAMP阻断，所以ADP对血小板的作用只能通过P2Y12受体途径，由此而能较特异地反映出氯吡格雷对P2Y12受体的抑制状况。试验采用阻抗法进行。在161例的测定中原先检测到的氯吡格雷低反应者38例(23.6%)，而经此法鉴别后确氯吡格雷低反应者仅为8例(5%)，而发现其中3例为P2Y12受体不足所致。由此项因此试验提示，在鉴定药物的抵抗性方面尚有许多未知因素需我们认真、细致地去探索。
根据2006年Michelson在欧洲心脏病杂志的建议，对氯吡格雷抵抗性的监测可首先对P2Y12受体特异的VASP 磷酰化作用检测 (流式细胞仪)，其次为Verify Now P2Y12 assay和ADP诱导的比浊法血小板聚集。
3.3 GPⅡb/Ⅲa拮抗剂监测：GPⅡb/Ⅲa拮抗剂在临床应用中存在出血和血小板减少的副作用，有人怀疑它与上述两种药物一样，可能存在“抵抗性”。目前认为采用能作床旁检测的Verify Now 分析仪是首选的试验。它在反映GPⅡb/Ⅲa功能受抑制程度上更为特异，与血小板聚集仪中测得的GPⅡb/Ⅲa受体阻断率一致。也有人报道在GPⅡb/Ⅲa拮抗剂可采用全血单个血小板计数法和PFA100TM仪测定。在比浊法血小板聚集仪中的ADP诱导的血小板聚集性测定虽然存在灵敏性不高，重复性差和技术要求高等不足，但在一般的临床实验室中仍不失为一项可以接受的监测手段。国产静脉注射型GPⅡb/Ⅲa拮抗剂(欣锥宁)现己在临床应用，实验室监测在这类药物中的意义将会累积更多的经验。
4 研制中的血小板检测装置
4.1 体外受刺激的血小板功能监测仪 为了模拟体内止血过程中所发生的血小板一系列反应(黏附、活化、聚集等)，除目前临床上已经应用的PFA100外，巳设计的检测仪器有Clot Signature Analyser(CSA)、Thrombotic Status Analyser(TSA)、高剪切滤过仪和锥板分析仪。
4.2 血小板介导的凝血酶生成 血小板活化时的负电荷磷脂(PF3)提供生成凝血酶的Ⅹ酶和凝血酶原酶，血小板的存在使凝血酶生成量提高5至6个剂量级。此外，GPⅡb/Ⅲa也可能影响凝血酶原转变成凝血酶，因为存在凝血酶原结合位点。除既往的PF3分析外，新近设计的Hemostatus Device(USA)则是在aPTT试验中加入不同浓度的血小板活化因子，观察凝固时间的缩短。此项试验能鉴定血小板数低70×109/L时的出血倾向，血小板无力症，并在GPⅡb/Ⅲa拮抗剂治疗的监测中有用。
4.3 测定凝血块物理特性的仪器 血栓形成动力学中的平衡、收缩和溶解反映了止血栓子进行止血的能力，测定止血时凝块的各种物理特性，人们可获得许多获得性和遗传性血小板的功能缺陷。目前巳商品化的仪器有：血栓弹力图(thromboelastography,TEG)和测量血小板收缩力(platelet contractile force，PCF)的仪器Hemodyne Instrument。TEG在预示出血倾向中的精确率(87%)高于活化的凝血时间(30%)和凝血图(51%)。应用于出血性疾病和外科术前检测。Hemodyne能反映血小板总体收缩力。占血小板蛋白34%的肌动蛋白在血小板活化时通过重新组装而构成收缩力，这种收缩力通过粘着在纤维蛋白网上的伪足，使整个血凝块收缩。所以，Hemodyne测定了纤维蛋白网上活化血小板的收缩力，反映了凝块的弹性模量和凝块僵硬性，提供了纤维蛋白/细胞网物理结构的一个量度。可用于止血实验室对出血性疾病、心脏病、外科和特护的检测。

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